更新時間：2022-09-01
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實驗方法原理：
細胞凍存和復蘇的基本原理是慢凍快解凍，已被證明能最大限度地提高細胞活力。目前常用甘油或二甲基亞砜作為細胞低溫保存的保護劑。這兩種物質可以提高細胞膜對水的滲透性，再加上緩慢的冷凍可以使細胞內的水從細胞中滲出，減少細胞內冰晶的形成，從而減少冰晶形成對細胞的損傷。復蘇細胞時應采用快速熔融的方法，以保證細胞外晶體在短時間內熔融，以避免因水緩慢熔融進入細胞形成細胞內重結晶而對細胞造成損傷。
實驗材料：細胞
試劑、試劑盒：
D-Hanks液 、小牛血清 、培養液、 青霉素、 鏈霉素、 胰蛋白酶、 HCl 、NaHCO3、 DMSO、 甘油
儀器、耗材：
微量加樣槍、吸頭、 離心管、 凍存管 、槍頭、 膠塞 、移液管玻璃瓶、 紅血球計數板、 記號筆、 醫用橡皮膏 、移液槍 、超凈工作臺 、離心機 、恒溫水浴箱、 冰箱、 倒置相差顯微鏡 、培養箱 、液氮冰箱
實驗步驟：
1、細胞凍存
①10%DMSO或甘油冷凍培養基的制備10～20%小牛血清。
② 對數生長期細胞用胰蛋白酶消化，懸液中生長的細胞直接移到15 ml離心管。
③離心機轉速1000轉，5分鐘。
④除去胰蛋白酶和舊培養基，加入適量配制好的冷凍培養基。用吸管輕輕吹氣使細胞均勻、計數，調整凍液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。
⑤細胞分成深低溫保存管，每管1～1.5ml。
⑥低溫保存管上標明細胞名稱、冷凍時間和操作人員。
⑦冷凍：標準的冷凍程序是冷卻速度為-1～-2°C/min。溫度低于-25℃時，可提高到-5°C~-10°C / min.。在-100℃時，可快速浸入液氮中。含有細胞的冷凍保存管也可以放在-20°C的冰箱里2個小時，然后放入-70°D的冰箱中過夜。取出冷凍管并將其移到液氮容器中。
2、細胞復蘇：
①將冷凍管從液氮容器中取出，直接浸入37°C溫水中，并不時搖晃，使其盡快融化。
②從37°C水浴中取出凍存管，打開蓋子，用移液器吸出細胞懸液，加入離心管滴下培養液10倍以上，攪拌均勻。
③離心，1000轉/分鐘，5分鐘。
④棄去上清液，加入10%小牛血清培養基懸浮細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37°C培養箱培養。
⑤第二天更換培養基，繼續培養。
注冊事項：
①從增殖期到形成致密單層細胞的培養細胞可用于低溫保存，但優選對數生長期細胞。冷凍前一天最好換培養基。
②將冷凍儲存管放入液氮容器或取出時，要做好防護工作，避免凍傷。。
③冷凍復蘇時，最好使用新配制的培養基。
當前位置：
